多莱泌文献解读丨肺特异性外泌体用于非小细胞肺癌中miRNA-126的传递

杂志：Nanoscale 影响因子：8.30

摘要：

工程化外泌体已成为癌症治疗中时髦的药物传递载体。因为外泌体的器官靶向性在全身给药后的器官散布中起着重要感化，使得外泌体做为药物载体变得非常有趣。

在那里，做者在文章中证明了乳腺癌细胞(MDA-MB-231)来源的外泌体(231-Exo)能够通过外泌体上过表达的整合素β4和癌细胞上的外表活性剂卵白C (SPC)之间的特定彼此感化被非小细胞肺癌细胞特异性内化。

在体外尝试中，231-Exo可以识别血液中的A549细胞并有效地逃脱免疫监控系统。一旦在外泌体载体中拆载microRNA分子，所产生的拆载有miRNA-126 的工程化外泌体 (miRNA126-231-Exo)便通过中断PTEN/PI3K/AKT信号通路，强烈按捺A549肺癌细胞的增殖和迁徙。静脉打针载有miRNA-126的外泌体可使小鼠产生有效的肺回巢效应。当在肺转移模子中停止测试时，miRNA-231-Exo在体内对肺转移的构成起到有效的按捺造用。

总之，文章的数据证明了在将外泌体做为药物载体设想的过程中，操纵外泌体的器官靶向性特征的可行性，并在小鼠模子中产生了有效的抗转移感化。

手艺示企图

在非小细胞肺癌中利用载有miRNA-126的外泌体(miRNA-231-Exo)的抗癌机造的示企图。外泌体(已经表达ITGβ4外表标识表记标帜)用于拆载miRNA-126分子。miRNA-231-Exo的器官靶向性特征有助于在肺转挪动物模子中的有效靶向感化。做者认为靶向感化是通过SPC+ A549肺癌细胞(存在于肺和轮回中)和ITGβ4+外泌体之间的特异性彼此感化介导的。一旦载有miRNA-126的外泌体被A549细胞内化，即可通过PTEN/PI3K/AKT路子介导的机造实现抗癌感化。

文章构想

1.外泌体的表征判定

将从MDA-MB-231组织培育提拔物的上清液平分别和纯化的乳腺癌来源的外泌体称之为231-Exo，并对其停止表征判定。起首利用Malvern Zetasizer测定外泌体大小散布，成果表白231-Exo样品的尺寸范畴为30-120nm（图A）。同时用AFM和TEM看察231-Exo样品的超微构造，看察到高度平均的纳米球形颗粒（图B），包罗TEM图片中放大图片中的脂量双层构造(图C)。在生物学尝试之前，通过BCA对总卵白的含量停止测定，其浓度为116.3μg /mL，同时在流式细胞术测定平分析231-Exo的CD9和CD63表达，成果发现其表达量别离为34.1%和44.2%（图D）。初步表白所提取的囊泡状颗粒为外泌体，并用于后续的尝试停止相关功用的验证。

2. 体外评估外泌体的癌细胞摄取效率

据报导，在231-Exo上的整合素 (ITGβ4)和在肺上皮细胞上的肺泡外表卵白C（SPC）在两者特异性连系的过程中中发扬关键感化(图A)。为探究A549细胞中SPC卵白的表达量，文章摘用了流式细胞术阐发停止检测，成果表白：与一般HELF细胞比拟，A549细胞中SPC程度超出跨越约3倍(图B，左图)。同时文章中也停止了细胞摄取比照研究，以评估外泌体在A549细胞和HELF细胞中的内化，通过对外泌体停止绿色荧光标识表记标帜并用流式细胞仪检测荧光强度，成果表白231-Exo能够在A549细胞中优先被吸收(图B，右图)。为领会ITGβ4的感化，文章还引用结肠癌细胞衍生的29-Exo视做比照，颠末流式细胞术尝试检测发现其231-Exo 外表的ITGβ4表达比29-Exo高了4倍摆布(图C，左图)。同时文章中也停止了A549细胞对那两种外泌体的摄取停止了比照，根据流式细胞仪检测成果能够看出：比拟于结肠癌细胞衍生的29-Exo，231-Exo愈加随便被A549细胞停止内化，而且ITGβ4与外泌体的吸收呈正相关(图C，右图)。为验证SPC能否在231-Exo被A549细胞内化的过程中起到感化，文章中利用抗体骚乱尝试停止验证，发现无论是加进抗SPC抗体仍是抗ITGβ4抗体，颠末流式细胞仪检测后发现被A549内化的231-Exo均显著降低，而且那一特征与抗体的体积程正相关（图D，图E）。此外，为揣度拆载miRNA后对外泌体231-Exo的影响，操纵共聚焦和流式细胞尝试检测，成果均表白231-Exo在拆载miRNA-231前后改变不大。

3. 外泌体对A549细胞的特异性识别和miRNA-231-Exo在血液中的不变性

为了模仿231-Exo对A549细胞的特异性识别过程，做者用PKH67对231-Exo停止染色，A549细胞用PKH26停止染色，并将两者在血液中一路共孵育，摘用流式细胞术停止阐发，发现有79.2%的A549细胞含有231-Exo（图A），同时操纵，共聚焦显微镜也发现了231-Exo(绿色)仅累积到A549细胞(红色)中，而不是血液中的其他细胞中（图B）。此外，为看察231-Exo能否被免疫系统识别，文章中特意用流式细胞术测定法检测了231-Exo中的CD47表达，也称为“不要食我”信号（有助于在心理前提下庇护非恶性细胞的免疫耐受性，但那种分子能够搀扶帮助差别癌症类型的癌细胞存活），成果表白：231-Exo中的CD47表达量显著高于比照组（图C）。为了进一步稳固数据，操纵共聚焦看察白细胞对231-Exo的摄取，但是尝试成果表白：没有看察到明显的外泌体摄取（图D）。那意味着231-Exo能够有效地逃离先天免疫细胞。为进一步检测拆载miRNA的外泌体的不变性，做者利用流式细胞术（图E）和共聚焦显微镜（图F）看察发如今37°C的血液中孵育8小时后，miRNA照旧连结高度完全性，而那促使文章进一步在肺转挪动物模子中测试其抗癌效果。

4. miRNA-231-Exo的体外增殖和迁徙按捺造用

为了研究miRNA-231-Exo的递送效率，将miRNA-126用FAM停止标识表记标帜，并转染到231-Exo中，3h后操纵共聚焦显微镜(A)或流式细胞术(B)看察miRNA-126-Exo被A549摄取的情状，成果表白：miRNA-126-Exo能被A549细胞有效吸收。同时文章也检测了miRNA-231-Exo对A549的细胞毒性， MTT和流式细胞术测定成果表白： A549细胞会遭到来源于miRNA-231-Exo的细胞毒性受损，而且空的231-Exo也产生了中等水平的细胞毒性(图5C和D)。为了评估miRNA-231-Exo对A549细胞迁徙的影响，停止了transwell试验(图5E)，成果表白：miRNA-231-Exo处置细胞的迁徙率低于比照组(图5E)。为了检测miRNA-231-Exo在PTEN/PI3K/AKT信号通路上的影响，停止了WB尝试和qPCR尝试以阐发以看察关键卵白因子，WB和qPCR成果表白：miRNA-231-Exo招致PTEN程度增加(图5F)。总的来说，231-Exo能够用做天然靶向载体，将miRNA-126递送至A549细胞，通过PTEN/PI3K/AKT信号通路招致增殖和迁徙按捺。

5. miRNA-231-Exo的体内抗转移感化

为评估在肺转移模子中miRNA-231-Exo的体内抗癌治疗效果。将A549细胞静脉打针到裸鼠体内。从第三天起，每3天通过尾静脉打针miRNA-231-Exo至小鼠体内，共打针7次。每三天丈量一次小鼠的体重。尝试完毕时摘集动物肺，量化转移灶数量，成果表白：miRNA-231-Exo治疗组有效地削减了肺转移病变的数量，而免疫组化阐发也证明了那一点（图A-C）。如图6D所示，在体重丈量上没有明显差别。那表白miRNA-231-Exo纳米载体具有生物相容性。

结论

文章证明了ITGβ4+乳腺癌细胞衍生的外泌体能够做为天然靶向纳米载体用于体外和体内庇护性miRNA-126递送。那些外泌体被SPC+肺癌细胞大量内化，例如A549细胞。负载miRNA-126的231-Exo通过调控PTEN/PI3K/AKT通路相关因子有效地按捺肺癌细胞增殖和迁徙效率。除此之外，载有miRNA-126的231-Exo还能够从先天免疫细胞中有效逃逸，并在在小鼠肺癌转移模子中展现出有效的癌症按捺效率。文章中的数据证明促使做者评估外泌体 “器官效应”的奉献，那是一个可能影响癌症治疗效果的关键特征。